JHM Family|西安交通大学郭烈锦院士团队 – 构建光合细菌CadR蛋白表面展示系统并促进重金属生物修复
发布时间：2025-06-26 点击次数：
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文章标题：JHM Family|西安交通大学郭烈锦院士团队 – 构建光合细菌CadR蛋白表面展示系统并促进重金属生物修复
内容：
通讯单位：西安交通大学动力工程多相流国家重点实验室
论文DOI: 10.1016/j.jhazmat.2025.138592
图文摘要
近日，西安交通大学动力工程多相流国家重点实验室郭烈锦院士团队在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Surface display of CadR protein on Rhodopseudomonas palustris CGA009 for enhanced heavy metal bioremediation”的研究论文。本研究以沼泽红假单胞菌CGA009为宿主构建了CadR金属结合蛋白表面展示系统。通过蛋白质组学和免疫组学的分析方法鉴定了融合蛋白在细胞表面的定位表达，并探究了不同光照强度下连接肽和不同的启动子对表面展示效率的提升效果。最后，通过Cd2+耐受和吸附分析证明了该系统的Cd2+吸附性能，验证了在多种干扰因素下的吸附特异性和稳定性，并将该系统应用于Cd废水处理。本项工作为光合细菌表面展示系统的开发提供了参考，同时为重金属污染废水提供了一种先进的生物修复策略。
重金属污染已成为全球亟需解决的生态与公共卫生难题。当前，虽然表面展示技术在重金属生物修复中展现出良好前景，但其在无氧光合紫色非硫细菌（PNSB）中的应用仍十分有限。PNSB具有代谢多样性与环境适应性，尤其适合用于污染环境下的原位修复，因此开发适用于PNSB的表面展示系统具有重要意义。本研究以沼泽红假单胞菌CGA009为宿主构建了金属结合蛋白表面展示系统。将金属结合蛋白CadR与外膜蛋白A（OmpA
）融合，并在CGA009中表达。SDS-PAGE和免疫荧光分析证实了融合蛋白的成功表达与表面展示。在功能验证方面，研究系统评估了连接肽与启动子以及不同光照强度对展示效率的影响。优化后的表面展示系统增强了宿主的重金属抗性，Cd2+最大去除率达到了95.6%。基于Langmuir等温线模型计算，Cd2+的最大生物吸附量为101.11 mg/g。此外，表面展示系统具备在复杂真实环境样本中的应用可行性。在多金属共存环境下仍能保持对Cd2+的高特异性吸附性能，在pH 6~8、20~35 ℃和1000~6000 lux条件下吸附效率维持在80%以上。本研究构建了适用于PNSB的表面展示系统，不仅拓展了光合细菌在环境生物技术中的应用边界，也为重金属污染废水处理提供了一种先进的生物修复策略。
微生物具备细胞内金属离子生物积累和隔离的能力，为环境中重金属的去除提供了潜在的途径，然而被污染区中营养物质和电子受体的缺乏会限制所使用细菌的生长和修复效果。光合细菌对各种环境条件和营养模式具有良好适应性，这种代谢灵活性使其具有作为生物修复剂的显著优势。
另外，微生物表面展示技术（指通过基因工程手段在宿主细胞表面定位表达外源蛋白或多肽）已被广泛应用于生物吸附剂、生物传感器、抗体生产和生物催化剂等方面。基于表面展示技术开发的生物吸附剂能够有效改善直接生物修复存在的菌种筛选步骤繁琐、细胞毒性强、无法适应高浓度重金属环境、吸附效率低等问题。
目前表面展示系统用到的宿主还局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等模式微生物，存在蛋白表达需要诱导、生物修复效果容易受到环境条件的干扰等问题。因此寻找能够降解污染物的现有微生物种群是一个潜在的优化方向，选择天然具备较强重金属响应能力和环境适应能力的光合细菌作为宿主有望进一步提高重金属生物修复效率和实际适用性。然而，目前表面展示技术在光合细菌中的应用较少，在光合细菌表面展示蛋白质或多肽用于重金属生物修复的研究未见报道。
图1. CadR表面展示系统用于Cd2+生物修复。a，CadR蛋白在沼泽红假单胞菌表面展示的示意图；b，重组质粒结构示意图。
图2. 鉴定表面展示系统的构建并验证其稳定性。a, 野生菌和6株工程菌菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图像；b, 野生菌和6株工程菌培养4d后提取的总蛋白样品进行10% SDS-PAGE分析的结果。蛋白条带通过考马斯亮蓝染色显示。目标蛋白大小为45-48kD；c, 使用His-tag Protein Purification Kit（Beyotime）纯化处理后的目标蛋白再次进行10% SDS-PAGE分析的结果；d, 免疫荧光图像确定融合蛋白在细胞表面表达。AlexaFluor488荧光素标记的His标签抗体检测融合蛋白N端的6*His标签，并显示其表达位置；e, 野生菌和6株工程菌在高光强和低光强下的生长曲线。
构建如图1b所示的融合蛋白表达载体，并由三亲本杂交转入光合细菌，通过菌液PCR进行筛选和鉴定。图2a显示了菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图像。结果显示，相比野生型CGA009，6种含有重组质粒的光合细菌都扩增出了对应长度的目标片段。这表明重组质粒已成功转入光合细菌并稳定复制。然后提取野生菌和6株工程菌的总蛋白质样品并用于10%的SDS-PAGE分析，图2b显示了考马斯亮蓝染色后的凝胶图像。相比于野生型CGA009，6株工程菌均在42~52 kDa之间出现明显的蛋白条带，与OmpA-CadR融合蛋白（OC：45.65 kDa；OGSC：47.3 kDa）大小一致。纯化后的融合蛋白条带(图2c)更清晰地呈现了这一结果。表明目标蛋白在6株工程菌中成功表达。
为了检测融合蛋白是否成功表达在光合细菌的细胞膜上，我们进行了免疫荧光分析。用AlexaFluor488标记的His-标签抗体孵育野生菌和工程菌，由于制样过程中未进行通透，抗体等大分子无法穿透细胞膜，因此只有暴露在细胞表面的蛋白才能与抗体结合。图2d显示，与对照组相比，6株工程菌表面均能够观察到明显的绿色荧光，这证明了基于光合细菌的表面展示系统的成功构建。
另外，为了评估表面展示CadR蛋白对光合细菌生长稳定性的影响，我们比较了CGA009和6株工程菌在不同光照强度下的生长情况（图2e）。除了CGA-Pb-OGSC，其他工程菌的生长情况与CGA009无明显差别，表明CadR蛋白的表面展示具有良好的应用前景。
连接肽和启动子提高不同光强下的表面展示效率
图3. 不同光强下连接肽和启动子对表面展示效率的影响。a, 高光强（左）和低光强（右）下野生菌和6株工程菌的流式细胞分析结果。野生型CGA009为阴性对照。结果以直方图模式展示，并标明了阳性细胞计数。b, 不同光强下野生菌和工程菌的相对荧光强度。其中以高光强下200 μL的CGA009培养物（OD660为0.4）对应的荧光强度数值为一个单位。
在融合蛋白之间加入一段具有疏水性和伸展性的肽链有利于融合蛋白的表达和正确折叠。GS-linker（GGGGSGGGGSGGGGS）是一种被广泛应用的连接肽，其柔性和疏水性不会扰乱蛋白质的功能结构域。用AlexaFluor488标记的His-标签抗体处理表达了融合蛋白的光合细菌，荧光强度值可以直接表征光合细菌表面暴露的CadR蛋白，而流式细胞术则能够量化表面展示了CadR蛋白的阳性细胞比率。在高光强和低光强条件下，CGA-OC的阳性细胞计数分别为42.9%和41.1%，而CGA-OGSC的阳性细胞计数分别为62.5%和66.1%。另外，相对荧光强度也显示了类似的结果。CGA-OC的荧光强度是CGA009的约5.9倍，而CGA-OGSC的荧光强度是CGA009的约8.2倍，比CGA-OC高了39%。基于这些结果，连接肽有潜力提高融合蛋白的表面展示效率。
Puc启动子和Puf启动子在以光合细菌为宿主表达蛋白的研究中被广泛应用。在高光强和低光强下，CGA-OGSC的阳性细胞计数和荧光强度均低于其他4组工程菌，这表明lac启动子在沼泽红假单胞菌中的活性要低于puc启动子和puf启动子。另外，在高光强下，CGA-Pa-OGSC和CGA-Pb-OGSC的阳性细胞计数和荧光强度明显比低光强下要高。这表明启动子puc-a和puc-b在高光强下具有更强的活性，能够有效提高融合蛋白的表达水平。CGA-Pd-OGSC和CGA-Pf-OGSC则恰恰相反，在低光强下具有更高的活性。在不同的光强下，选择对应的高活性启动子能够提高其下游蛋白的表达水平。
表面展示系统的Cd2+耐受性和吸附效果
图4. 表面展示系统在重金属生物修复中的应用。探索镉耐受性（a）和吸附率（b）的实验流程示意图。c，野生型和工程菌在不同Cd2+浓度下高光强和低光强条件下的最大生长密度。d，高光和低光条件下野生型和工程菌培养基上清液中Cd2+的残留浓度。
表1. 不同光强下野生菌和工程菌Cd2+生物吸附的Langmuir模型参数。
在高光强下，10mM Cd2+严重抑制了CGA009的生长，而CGA-Pa-OGSC的最大OD660相对0mM无显著差异，CGA-Pb-OGSC的最大OD660则比0mM提高了28.1%。低光强下光合细菌的生长状态比高光强下要差，但响应不同浓度Cd2+的趋势与高光强类似。表明表面展示CadR蛋白能够提高沼泽红假单胞菌对高浓度Cd2+的耐受性。
另外，细菌在添加了1mM Cd2+的培养基中生长至稳定期后，高光强下CGA009的上清液中残留了56.8 mg/L Cd2+，吸附率只有46.5%，而CGA-Pa-OGSC和CGA-Pb-OGSC的上清液残留量分别为9.9 mg/L和8.1 mg/L，吸附率达到了90.7%和92.4%。低光强下，CGA009的上清液残留了46.4 mg/L Cd2+，而CGA-Pd-OGSC的上清液残留量仅为4.7 mg/L，吸附率达到了95.6%。此外，采用Langmuir等温模型对吸附数据进行拟合，拟合效果较好。高光强下CGA-Pa-OGSC和CGA-Pb-OGSC的最大生物吸附量分别为94.25和86.21 mg/g，约为野生型的1.9倍和1.7倍。低光强下，CGA-Pd-OGSC和CGA-Pf-OGSC的吸附能力均为野生型的2倍以上。本研究构建的表面展示系统能够适用于高浓度Cd2+的环境，具有较高的Cd2+去除率。
生物吸附选择性和稳定性分析
图5. 表面展示系统的生物吸附选择性和稳定性分析。a, 高光强（左）和低光强（右）下野生菌和工程菌对不同二价金属离子的吸附率。CGA-Pa-OGSC(HL)和CGA-Pd-OGSC(LL)在pH 5~9（b）、15~40℃（c）的Cd2+吸附率。d, 野生菌和工程菌在中光强（ML, 3000 lux）下的Cd2+吸附率。e, 高光强和低光强下野生菌和工程菌在Cd废水中的生物吸附率。
在高光强和低光强下，野生菌和工程菌对混合金属溶液中的Cu2+和Zn2+的吸附率没有明显差别，但工程菌对Cd2+的吸附率显著高于野生菌，表明该系统对Cd2+具有很强的特异性，其他金属的存在不会干扰表面展示系统对Cd的选择性吸附。另外，生物吸附剂在不同环境条件下的稳定性对其实际应用非常重要。结果显示，在pH6~8、20~35℃和中光强条件下，表面展示系统能够维持80 %以上的去除效率，且废水中的复杂成分不会干扰表面展示系统的Cd吸附性能，最高去除率达到94.3%。这些结果表明表面展示系统在常规条件下能够稳定发挥吸附功能，具有广泛的可行性。
本研究利用基因工程技术在一种环境友好型菌株沼泽红假单胞菌CGA009细胞表面展示了一种金属结合蛋白CadR。连接肽的加入有利于融合蛋白的表达，puc启动子和puf启动子在沼泽红假单胞菌中的活性显著强于lac启动子，进一步提高了CadR的表面展示效率。不同类型的puc启动子和puf启动子的活性受到光照强度的影响，这可能与光合细菌为了适应不同光照条件而合成不同类型的光捕获复合物有关。表面展示工程菌缓解了高浓度Cd2+对光合细菌的生长抑制作用，并且对Cd2+的去除率达到了95.6%。通过Langmuir等温线分析，该系统对Cd2+的最大生物吸附量为101.11 mg/g。该系统具备在复杂真实环境样本中的应用可行性。多种金属离子的存在不干扰该系统对Cd2+的特异性吸附，在pH 6~8、20~35 ℃和1000~6000 lux条件下能够稳定地维持80%以上的吸附效率。另外，该系统对一种人工Cd废水中的Cd中的去除效率达到94.3 %。这些结果表明，基于光合细菌的CadR表面展示系统能够增强宿主的重金属抗性并具有Cd2+吸附能力，有潜力应用于镉污染废水的生物修复。
作者介绍
第一作者：王敏敏，在读博士研究生。主要研究方向为表面展示金属结合蛋白对光合细菌重金属生物修复和纳米材料生物原位合成的影响，以及纳米材料-光合细菌复合体系对光发酵产氢的影响。
邮箱：4122103012@stu.xjtu.edu.cn
通讯作者：曹稳，西安交通大学动力工程多相流国家重点实验室副研究员。研究方向包括：光生物发酵制氢、微藻固碳、有机固废热化学转化中污染控制理论等。已在Energ Convers Manage、Waste Manage、Bioresour Technol等国际期刊发表SCI论文40余篇，ESI高被引论文4篇，撰写英文著作章节1篇。
邮箱：caowenxjtu@mail.xjtu.edu.cn
通讯作者：郭烈锦，中国科学院院士，世界科学院院士，工程热物理与能源利用学家，我国能源动力多相流及氢能学科的主要学术带头人，主要从事能源动力多相流及氢能科学技术研究。现任西安交通大学教授、博导，动力工程多相流国家重点实验室主任，国际清洁与可再生能源研究中心创始主任，西安交通大学新能源科学与工程专业创始及学科带头人，国家自然科学基金项目“能源有序转化”基础科学中心负责人。
邮箱：lj-guo@mail.xjtu.edu.cn
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